脂肪干細胞在眼科的應用及研究進展

　　脂肪干細胞adipose-derived stem cells,ADSCs是存在于脂肪組織的間充質干細胞,具有多向分化潛能,在特定的條件下可以分化為脂肪細胞、成骨細胞、成軟骨細胞等中胚層細胞,甚至可以跨胚層分化為神經細胞等外胚層細胞及肝細胞等內胚層細胞。ADSCs還有易于獲取、對取材區損傷小等眾多優勢,使其成為組織修復等領域的熱點之一。

　　本文對ADSCs的生物學特性及其在眼科領域的研究進行了分類總結,以期為ADSCs在眼科的應用研究給予有益的提示。

　　脂肪干細胞adipose-derived stem cells,ADSCs是來源于脂肪組織,具有多向分化潛能的間充質干細胞。作為成體干細胞重要組成的ADSCs,因其不存在倫理學問題、易于獲取、體外增殖迅速及低免疫原性等眾多優勢,引起大家廣泛關注。

　　在眼科領域,ADSCs相關的研究取得了長足進展。我們就ADSCs的生物學特性及其在眼科領域的研究成果、研究中存在的問題及應用前景做一歸納總結,以期對今后的相關研究提供一些借鑒和思路。

　　1.ADSCs概述

　　1.1 ADSCs的來源

　　2001年,Zuk等首次于抽脂術后脂肪組織廢棄液中分離出的脂肪血管基質成分中獲取了脂肪組織來源干細胞。其中,脂肪血管基質成分是ADSCs、內皮細胞、平滑肌細胞、周細胞、成纖維細胞、淋巴細胞及脂肪前體細胞等組成的細胞混合物。

　　ADSCs的獲取簡單、方便,可以從人脂肪抽吸術所得脂肪組織中大量獲得,約400～600mg脂肪組織即可獲得5×105個干細胞。

　　1.2 ADSCs的鑒定及多向分化潛能

　　研究發現,ADSCs不僅與骨髓間充質干細胞在形態上比較相似,而且均表達間充質干細胞的表面標志物CD73,CD90和CD29,而不表達造血及內皮細胞表面標志物CD31,CD34,CD45和CD14。但是兩者之間也存在一定差異,如CD106在ADSCs中不表達而在骨髓間充質干細胞中陽性表達;CD49d在ADSCs中表達而不在骨髓間充質干細胞表達。

　　目前,大多數文獻仍以成脂、成骨等多向分化能力的鑒定作為ADSCs鑒定的主要方法。

　　近年來,隨著ADSCs誘導分化方面研究的深入,已經證實ADSCs不僅能夠分化為中胚層細胞如脂肪細胞、成骨細胞、心肌細胞等,而且可跨胚層分化為外胚層細胞如神經細胞等、內胚層細胞如肝細胞等。

　　2.ADSCs在角膜上皮的應用研究

　　角膜上皮來源于角膜緣干細胞的定向分化,具有較強的再生能力。但當角膜嚴重損傷后引起大范圍角膜周圍纖維細胞浸潤、角膜翳及角膜瘢痕形成等,最終將導致角膜緣干細胞缺失limbal stem cell deficiency,LSCD。

　　角膜移植是LSCD較好的治療方法,但因為供體不足、術后植片衰竭及免疫排斥反應嚴重限制了這種治療。干細胞移植不失為一個替代方法。

　　ADSCs在角膜上皮的應用可以分為兩類。一類是ADSCs對受損角膜上皮愈合的應用研究;另一類是ADSCs向角膜上皮細胞分化的研究。

　　2.1 ADSCs

　　對受損角膜上皮愈合影響的應用研究研究表明,ADSCs具有促進角膜上皮愈合,降低免疫反應的作用。Agorogiannis等報道了一例以自體ADSCs治療持續性角膜上皮缺損的患者。患者因橄欖樹葉造成角膜上皮創傷,形成潰瘍,遷延不愈。對患者進行自體ADSCs移植,術后11d角膜上皮開始愈合,術后1mo,患者角膜上皮完全愈合。術后6mo隨訪,角膜上皮保持完整。

　　Zeppieri等以角膜堿化學傷的大鼠作為實驗動物,局部進行人ADSCs的移植。組織學結果顯示局部進行ADSCs移植后,受損動物角膜完全愈合,與對照組相比免疫細胞較少。說明ADSCs促進受損角膜上皮愈合。

　　Lin等將ADSCs懸液采用兔結膜下注射的方法治療實驗兔眼表堿化學傷,研究發現實驗組角膜愈合的速度比對照組更快,組織學檢測顯示實驗組形成了5～6層角膜上皮細胞層,而對照組為2～3層角膜上皮細胞層。

　　以上研究提示ADSCs移植于受損的角膜上皮,可以促進角膜上皮的再生和修復,加速角膜的愈合。然而,ADSCs在促進受損角膜上皮愈合的同時,是否其本身也有分化的傾向,以及最終的轉歸如何等問題值得進一步探討。

　　2.2 ADSCs向角膜上皮細胞分化的研究

　　近年,ADSCs向角膜上皮細胞分化的潛能得到了證實。鐘劉學穎等在體外探究了不同的誘導體系對人ADSCs的分化作用。誘導體系中主要包括DMEM/F12體系、KM體系以及前兩者1:1的混合體系DMEM/F12/KM體系,并添加不同濃度的表皮生長因子epidermal growth factor,EGF。

　　結果顯示,不同濃度梯度細胞生長因子的KM體系誘導21d,廣譜角蛋白AE5陽性細胞約占90%以上,其中40g/L、50g/LEGF組AE5陽性表達率達到98%以上。

　　Martinez-Conesa等將ADSCs培養于細胞外基質層,免疫熒光結果顯示細胞角膜上皮角蛋白CK3/76陽性表達,PCR結果顯示細胞表達了祖細胞表面標志物p63及ABCG2,角膜上皮標志物CK12陽性表達。Western結果顯示誘導后ADSCsp63陰性、CK3/76和CK12弱陽性。

　　Ho等分別研究了眼眶脂肪組織來源和皮下脂肪組織來源的ADSCs誘導分化為角膜上皮樣細胞的能力。實驗分為3組:第1組,角膜上皮細胞和ADSCs混合培養;第2組,角膜上皮細胞來源的條件培養基培養ADSCs;第3組,角膜上皮細胞和ADSCsTranswell共培養。

　　5d后熒光染色眶脂來源的ADSCs第1組混合培養的ADSCsCK3陽性表達,第2組、第3組未觀察到陽性結果。皮下脂肪來源的ADSCs僅在第1組有少量表達。

　　Nieto-Miguel等研究了皮下脂肪組織誘導分化為角膜上皮樣細胞的能力。實驗分為基礎培養液組basal culture medium,BM、角膜上皮細胞來源條件培養液BM conditioned with human corneal epithelial cells,HCEcBM、角膜緣成纖維細胞來源條件培養液組BM conditioned with limbal fibroblasts,LFcBM,各組分別培養于普通培養皿、Ⅳ型膠原包被的培養皿中。

　　誘導第15d,光鏡下觀察到HCEcBM組細胞發生了上皮樣改變。誘導第1,8,15,22d,RT-PCT結果顯示HCEcBM組細胞CK12明顯增高,這一結果被Westernblotting結果證實。

　　誘導后15d免疫熒光檢測顯示,HCEcBM組、LFcBM組細胞核周區域CK12陽性表達。另外,實驗結果表明普通培養皿、Ⅳ型膠原包被的培養皿對于誘導細胞分化方面沒有顯著的統計學意義。

　　這些結果提示ADSCs可誘導為角膜上皮樣細胞,具有分化為角膜上皮細胞的潛能,但細胞在體條件下是否能保持角膜上皮細胞表型、細胞分化過程中細胞是否有其他表型等問題,需要進一步實驗證實。

　　3.ADSCs在角膜基質的應用研究

　　角膜基質層約占角膜厚度的9/10,由膠原纖維、角膜細胞等組成。其中,膠原纖維的有序排列是角膜透明的基礎,也使角膜具有了一定的彈性和韌性。角膜基質損傷后不能再生,通過瘢痕修復損傷部位,影響角膜的透明性。

　　ADSCs可以減低損傷部位的免疫反應,并且成功修復角膜基質,形成板層結構。Arnalich-Montiel等將人ADSCs直接注入活體兔角膜內,術后12wk仍可檢測到人ADSCs的存在,沒有免疫排斥的現象發生,并且免疫學檢測顯示,細胞表達角膜基質細胞特異性蛋白聚糖keratocan,提示在體內微環境誘導下人ADSCs向角膜基質細胞方向分化。

　　鮑慧婧等將自體兔ADSCs與聚乳酸-聚羥基乙酸共聚物polylactic-co-glycolic acid,PLGA支架復合后移植于兔角膜基質,成功重建受損的兔角膜基質。

　　研究顯示兔ADSCs在PLGA支架上生長良好,材料12wk以后降解,角膜基本恢復透明。HE染色顯示新生角膜基質與正常組織相似,電鏡下可見原缺損部位膠原纖維直徑與正常組織無統計學差異。

　　Du等采用不同的誘導液在體外誘導人ADSCs向角膜基質方向分化。實驗因培養方法不同,分為纖維蛋白凝膠組和微球法培養組,角膜基質誘導液培養3wk。免疫學檢測顯示keratocan及硫酸軟骨素在兩組不同方法培養的細胞的表達,其中微球法培養組比纖維蛋白凝膠組表達廣泛。

　　Keratocan的表達通過RT-PCR方法得到證實。研究結果提示兩種方法均誘導人ADSCs分化為角膜基質細胞樣的細胞。

　　Espandar等將人ADSCs接種于透明質酸類支架,以細胞質內膜熒光蛋白分子為標記,移植于兔角膜基質層。術后10wk檢測發現,人ADSCs不僅在基質層生長良好,而且表達了角膜基質細胞特異性蛋白keratocan、醛脫氫酶、玉型膠原等。

　　雖然上述研究表明ADSCs向角膜基質樣細胞分化,提示了ADSCs的分化潛能。但是,ADSCs分化后,是否有部分細胞仍具有干細胞特性,是否可以不斷分化為角膜基質細胞等問題需要進一步的相關實驗予以探究。

　　4．ADSCs在視網膜的應用研究

　　視網膜由內層的神經上皮及外層的視網膜色素上皮構成,具有感光并對光刺激進行處理的重要功能。

　　許多視網膜疾病嚴重損害視力甚至致盲,如視網膜遺傳性、變形性病變,而目前的治療方法不能阻止其進展。干細胞在視網膜疾病的相關研究為視網膜疾病治療提供了一個新的探索方向。

　　ADSCs在添加合適的誘導液后,可以分化為視網膜光感受器細胞、色素上皮細胞及神經膠質細胞等。

　　許卓再等以不同的誘導方案嘗試將大鼠ADSCs誘導分化為視網膜光感受器細胞及視網膜色素上皮細胞。實驗主要分為對照組、單獨誘導組、聯合誘導組。

　　主要誘導劑為EGF、激活素A、牛磺酸、視黃酸、視網膜細胞提取液等。各誘導組在誘導28d后細胞均在一定程度上表達了視紫紅質、上皮細胞骨架蛋白CK及神經嵴細胞來源S-100蛋白。

　　其中,單獨誘導組各組間誘導效應相似,而聯合誘導組中包含EGF、牛磺酸、視黃酸的誘導組效應較好。提示ADSCs具有向光感受器及視網膜上皮細胞分化的潛能。

　　2009年Vossmerbaeumer等采用人或豬的視網膜上皮細胞來源條件培養基誘導人ADSCs向視網膜色素上皮retinalpigmentepithelium,RPE方向分化。誘導液主要包括RPE來源的條件培養液、血管活性腸肽等,以不同的組合構成相應分組。

　　誘導5～8d后,結果顯示ADSCs表達了視網膜色素上皮細胞特異性蛋白BestroPHin,CK8,CK18及RPE65。促黑素細胞激素melanocyte-stimulating hormone,MSH誘導分化的ADSCs色素顆粒的形成。

　　晁煒靜等體外誘導人ADSCs向視網膜細胞分化,免疫熒光顯示誘導后細胞表達視紫紅質和Pan-CK,提示細胞向光感受器細胞和視網膜色素上皮細胞分化。

　　2010年,Yang等采用糖尿病大鼠作為動物模型,探討ADSCs移植對于糖尿病視網膜病變的改善。

　　ADSCs移植術后1wk,血糖水平顯著降低。伊文思藍染色基本沒有滲漏,提示血視網膜屏障的完整性提高。術后可以觀察到ADSCs存在于大鼠視網膜,并且表達了光感受器特異性蛋白視紫紅質和星形膠質細胞特異性蛋白膠質纖維酸性蛋白glial fibrillary acidic protein,GFAP。

　　韓國學者Yu等將人ADSCs移植于C57/BL6小鼠,以GFP作為示蹤蛋白探究ADSCs在發育階段鼠眼中的分化及轉歸。實驗根據小鼠出生不同天數、移植后存活天數分組。

　　結果發現,部分ADSCs表達了成熟神經元的標志物微管相關蛋白質microtubule-associated protein2,MAP-2、神經膠質細胞標志物GFAP。出生后第5,10d,移植后7d被處死的小鼠比其他組分化的較好。然而,與其他干細胞如腦前體細胞相比,ADSCs向視網膜方向的分化非常有限。

　　ADSCs向視網膜神經及色素上皮細胞的分化研究中,細胞雖然表達了光感受器細胞的標志物,但是仍存在細胞是否具有正常光感受器細胞的功能以及分化細胞占ADSCs的比例等問題。

　　5．展望

　　ADSCs的發現,極大地豐富了干細胞庫,并且在眼科領域的深入探索為Stevens-Johnson綜合征、嚴重的細菌感染及化學燒灼傷所致角膜緣干細胞缺失、視網膜遺傳性、變性性疾病等難治性眼病提供了一個可能的選擇。

　　目前,已經有關于ADSCs向角膜上皮細胞、角膜基質細胞及視網膜神經、色素上皮細胞分化及應用研究的報道。然而,這些研究仍存在許多問題:

　　1ADSCs的純化問題。

　　2絕大部分研究為動物實驗。在動物實驗得到的結果,是否在人體也能得到相似的結果。

　　3ADSCs在眼科的應用研究還停留在細胞表型的分化研究。對于ADSCs分化為某種成熟細胞表型后是否具備相應的功能。

　　4分化過程中的哪些通路和因子起到關鍵作用。

　　5ADSCs在眼科領域的誘導分化尚未有成熟的誘導方案。

　　綜上所述,ADSCs在體外或體內條件下具有促進角膜損傷愈合、向角膜上皮細胞、基質細胞、視網膜神經細胞、視網膜色素細胞分化的可能,有望成為眼科難治性疾病治療的新途徑。

來源：藥品資訊網信息中心

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