下呼吸道感染病原學分子診斷技術進展

下呼吸道感染是一種常見的感染性疾病，嚴重危害人類健康。據世界衛生組織的統計，2008年全球下呼吸道感染的病死率為6.1%，居人類十大死因的第3位。下呼吸道感染的常見病原體包括細菌、病毒、支原體、衣原體及寄生蟲等。研究結果顯示，對病原體準確可靠的診斷是有效控制下呼吸道感染、提高治愈率和降低細菌耐藥性的重要保證。但目前臨床常規采用的細菌培養、病毒分離等病原學檢測技術普遍存在著耗時長、敏感度差等不足，大大降低了檢測效率，難以對臨床抗感染治療發揮有效的指導作用。

近年來，隨著分子生物學的飛速發展，病原學診斷與分子生物學技術密切結合，形成了病原學分子診斷技術。這一新興技術的崛起，徹底打破了傳統的主要靠培養檢測的局限性，并憑借其快速、準確、敏感及特異等優勢在病原學診斷方面凸顯作用，為下呼吸道感染的診斷、治療及新型病原體的檢出和細菌耐藥機制的研究等方面提供可靠的技術支持。現將下呼吸道感染的病原學分子診斷技術的進展綜述如下。

一、核酸檢測

分子生物技術最早用于病原學診斷是從核酸檢測開始。核酸檢測技術發展至今，大致經歷了核酸雜交、分離、擴增及基因芯片、PCR、DNA圖譜分析及DNA測序等技術。

1．核酸雜交：最早出現的核酸雜交技術是利用生物素、放射性同位素、酶等標記的探針與樣品的核酸片段進行雜交，通過檢測特異的雜交信號確定病原體。該技術的特點是特異度和敏感度均高，幾乎接近100%，特別是后續發展的熒光原位雜交 FISH技術，在病原學分子診斷的早期起到了至關重要的作用。核酸雜交技術的關鍵在于探針的設計，目前，軍團菌探針、肺炎支原體探針、EB病毒探針、呼吸道合胞病毒探針及肺孢子菌探針等已陸續問世，使下呼吸道感染的典型和非典型病原體的診斷成為可能。Edelstein等制備的cDNA探針具有軍團菌屬的特異性，經美國基因探針公司改進后，成為商用探針試劑盒，已被臨床實驗室采用。Hyman等制備的DNA探針可檢出含量僅為0.1 ng的肺炎支原體DNA。Hernandez等采用核酸雜交技術成功檢測到呼吸道合胞病毒。核酸雜交技術是其他核酸檢測的基礎，為病原學分子診斷的開展邁出了重要的一步。

2．聚合酶鏈反應PCR：自20世紀80年代問世以來，PCR技術被廣泛應用于各個領域，具有劃時代的意義。從最早的標準PCR，逐漸發展到多重PCR multiplex PCR、巢式PCR nested PCR、反轉錄PCR RT-PCR以及實時定量PCR real-time quantitative PCR等，目前PCR技術已有十幾種，其擴增能力和精確性逐步提高。標準PCR主要是針對某單一基因片段進行擴增，多重PCR可同時擴增多個基因片段，而巢式PCR以及目前廣泛應用的實時定量PCR在檢測準確性方面則更具優勢。

眾所周知，對于肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌等苛養菌以及嗜肺軍團菌、肺炎支原體等非典型病原體來說，臨床分離、培養難度很大，大大降低了臨床檢出率，而PCR技術可以彌補這一缺陷。Morozumi等采用實時定量PCR技術，從429例成人和兒童肺炎臨床標本中檢測到肺炎鏈球菌的lytA基因、軍團菌的mip基因以及肺炎支原體的16S rRNA，整個檢測過程僅耗時2h，且與傳統的細菌培養方法相比，敏感度和特異度均大大提高。除了上述病原體外，Kawazu等還應用實時定量PCR技術在呼吸道分泌物中檢測到了曲霉，突破了曲霉培養的種種限制。不僅針對細菌，PCR技術在病毒診斷方面也毫不遜色。Beckham等利用反轉錄PCR方法對194例合并呼吸道病毒感染的COPD患者的咽拭子樣本進行了病毒檢測并與常規分離和血清學檢測方法進行了比較，結果發現PCR方法的病毒檢出率為41. 8%，而常規方法的檢出率僅為23.4%，這一結果對于COPD急性發作患者的病原學快速診斷頗具意義，還可以指導用藥，縮短患者住院時間。

國內對于病原體PCR診斷的研究也十分迅猛，方健等利用PCR技術可同時檢測15種呼吸道病原體。2003年SARS暴發期間，研究者正是采用了實時定量PCR技術和DNA測序技術才能在短短3個月內將SARS的元兇鎖定為新型冠狀病毒。2009年，我國發現的新型布尼亞病毒也是應用了此項技術。

另外，PCR技術在檢測細菌耐藥方面也發揮了重要作用。研究結果表明，與細菌耐藥相關的因子如新德里金屬-β-內酰胺酶1（NDM-1）、超廣譜β-內酰胺酶ESBL、青霉素結合蛋白2a PBP2a、外膜孔蛋白OprD等都有對應的基因片段，因而可以通過設計不同的引物來檢測這些基因。Diene等采用實時定量PCR技術檢測了128株菌株中NDM-1基因，顯示了該技術對碳青霉烯類抗生素耐藥機制研究的快速、敏感等優勢。管希周等利用多重PCR技術發現了同時產AmpC β-內酰胺酶AmpC和ESBL的肺炎克雷伯桿菌及其耐藥表型。應用PCR技術進行耐藥研究，避免了細菌分離、培養及藥敏試驗等繁瑣的操作步驟。近年來，隨著多種PCR方法聯合應用以及大量商品化試劑盒的出現，該技術正日益走向成熟。

3．DNA圖譜分析：除了核酸雜交、PCR等針對病原體某一特定核酸片段進行檢測的技術外，還有針對病原體全基因組DNA進行檢測的技術。目前常用的技術包括質粒DNA圖譜分型、染色體DNA限制性內切酶分析以及DNA脈沖場凝膠電泳分型3種技術。這些技術通過采用凝膠電泳、圖譜分析等方法檢測病原體全基因組DNA，從而為病原體檢測和分型提供了新的手段。目前，質粒DNA圖譜以及DNA脈沖場凝膠電泳分型技術已應用于葡萄球菌的分型和耐甲氧西林金黃色葡萄球菌 MRSA耐藥機制的研究。質粒圖譜分型可適用于一切有質粒的病原體；DNA脈沖場凝膠電泳常作為分子生物學分型方法的“金標準”，但以上這些技術也存在著DNA圖譜分析較復雜、分辨力較低及再現性較差等缺點。

4．DNA測序：對于病原體核酸不僅要了解其整體結構、片段組成，還要了解DNA堿基種類、數目以及排列等，這就需要應用DNA測序技術。1977年Sanger和Maxam分別利用雙脫氧鏈終止法和化學降解法測定了DNA序列，此后DNA測序技術開始應用于生物、醫學、法醫及藥學等領域。早在1985年，英國Lambden即利用該技術測定了呼吸道合胞病毒磷酸化蛋白編碼的核苷酸序列，近年來，這一技術已經用于真菌、細菌、結核桿菌及弓形蟲等病原體的檢測，尤其在結核桿菌檢測方面與核酸雜交技術相比費用明顯降低。但由于測序技術對序列要求較高，因而只能檢測到細菌潛在變化序列的很小一部分，因此目前該技術主要應用于病毒檢測，如2007年我國溫嶺第一人民醫院發現了導致小兒下呼吸道感染的新型病毒-Wu多瘤病毒亞洲種，并完成了測序工作。但由于DNA測序技術條件嚴格、儀器復雜及費用昂貴等原因，目前一般臨床實驗室尚無法進行，主要用于科學研究。

二、蛋白質檢測

對于生物體而言，核酸和蛋白質是決定其生物學特性的重要物質，核酸是生物的遺傳物質，而蛋白質則是生命活動的體現者。因此，對病原體的檢測，除了針對核酸以外，還要研究其蛋白功能。隨著人類基因組計劃的完成，基因組學的研究重點也轉移到了蛋白功能的研究，而后基因時代應運而生的蛋白質組學，也為呼吸道病原體的研究提供了一個新的平臺。針對病原體蛋白質組學的檢測技術主要是二維電泳和質譜或色譜分析，即將病原體的蛋白通過二維電泳轉移到膠上，再經圖像分析，選取特定的蛋白質斑點，經酶解和后續的質譜或色譜分析以及數據處理，確定病原體的屬性，目前該技術主要用于細菌鑒定和耐藥機制方面的研究。國外學者曾報道用蛋白質組學質譜技術檢測了MRSA和甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌 MSSA的蛋白質組學，并分析比較了兩者的差異，從而證實了蛋白質組學在病原診斷方面的作用。另外，Schaar等利用二維電泳和質譜分析方法發現，卡他莫拉菌的外膜囊泡具有很高的生物學活性，是運輸細菌致病因子的關鍵結構；Soualhine等發現，肺炎鏈球菌突變株的磷酸鹽轉運蛋白與細菌耐藥有關。

三、生物芯片技術

近年來，生物芯片技術得到了迅猛發展，為病原體的檢測提供了新的技術平臺。目前用于病原體檢測的生物芯片主要包括基因芯片、蛋白芯片以及微流控芯片實驗室等，這些技術憑借其微型化、高通量及自動化等優勢，在微生物病原體檢測、種類鑒定、功能分析診斷、基因分型、突變篩查以及基因組監測等方面正在發揮著越來越重要的作用。

基因芯片是最早用于病原體的分子生物學芯片。將代表各種病原體的特殊基因信息印制在一張基因芯片上，再經反轉錄過程與樣品結合，即可檢測出樣本中有無特異病原體基因及其表達水平，由此判斷感染的病原體、感染進程以及宿主反應等。目前，由于許多病原體的基因組測序工作已經完成，基因芯片技術正在逐漸應用于臨床。除了基因芯片外，其他生物學芯片技術也日臻成熟，如Causse等利用DNA芯片和多重反轉錄PCR方法檢測了呼吸道合胞病毒；2003年我國利用自主研制的全基因組芯片成功檢測出了SARS病毒。同樣，蛋白芯片在病原體分子診斷方面也有著廣闊的發展空間，以此為平臺可以檢測出病原體間蛋白表達的差異，尤其對于呼吸道病毒。如楊侃等利用蛋白芯片技術檢測了1022例兒童急性呼吸道感染患者的病原體，其病毒陽性檢出率與ELISA法無明顯差異，進而也驗證了芯片技術在臨床病原體檢測方面的高效性和便捷性。

另外一種值得一提的是微流控芯片技術，也稱芯片實驗室，該技術具有高通量、高效率、低消耗及集成化等特點，在病原體核酸及蛋白檢測方面的優勢正日益凸顯。Song等利用該技術不僅實現了細菌分選，還實現了計數和鑒定；Sun等采用微芯片平臺對禽流感病毒的RNA進行了快速檢測。微流控芯片技術雖然剛起步，但其在分子診斷方面將具有廣闊的應用前景。

四、展望

綜上所述，與傳統的細菌培養等檢測手段相比，分子診斷技術具有特異、敏感、快速及便捷等優勢，必將在下呼吸道病原學診斷方面發揮越來越重要的作用。盡管目前這些技術尚存在假陽性、假陰性等不足，且操作復雜，成本昂貴，甚至有些技術仍處于起步和基礎研究階段，臨床尚有待推廣。但隨著經濟水平的提高和科技的不斷發展，分子生物學技術在臨床中的轉化應用將逐漸成為臨床病原學診斷的主要手段。在不久的將來，借助于分子診斷技術，通過一滴血、一滴尿以及其他體液或組織，就可在最短時間內檢測出病原體，實現快速、便捷、高效的病原學分子診斷，為臨床治療提供指導，同時也將大大降低醫療費用，減輕社會的經濟負擔。

來源：藥品資訊網信息中心

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