微生物制藥的一般工藝流程

工業微生物技術是可持續發展的一個重要支撐，是解決資源危機、生態環境危機和改造傳統產業的根本技術依托。工業微生物的發展使現代生物技術滲透到包括醫藥、農業、能源、化工、環保等幾乎所有的工業領域，并扮演著重要角色。歐美日等國已不同程度地制定了今后幾十年內用生物過程取代化學過程的戰略計劃，可以看出工業微生物技術在未來社會發展過程中重要地位。

微生物制藥技術是工業微生物技術的最主要組成部分。微生物藥物的利用是從人們熟知的抗生素開始的，抗生素一般定義為：是一種在低濃度下有選擇地抑制或影響其他生物機能的微生物產物及其衍生物。有人曾建議將動植物來源的具有同樣生理活性的這類物質如魚素、蒜素、黃連素等也歸于抗生素的范疇，但多數學者認為傳統概念的抗生素仍應只限于微生物的次級代謝產物。近年來，由于基礎生命科學的發展和各種新的生物技術的應用，報道的微生物產生的除了抗感染、抗腫瘤以外的其他生物活性物質日益增多，如特異性的酶抑制劑、免疫調節劑、受體拮抗劑和抗氧化劑等，其活性已超出了抑制某些微生物生命活動的范圍。但這些物質均為微生物次級代謝產物，其在生物合成機制、篩選研究程序及生產工藝等方面和抗生素都有共同的特點，但把它們通稱為抗生素顯然是不恰當的，于是不少學者就把微生物產生的這些具有生理活性（或稱藥理活性）的次級代謝產物統稱為微生物藥物。微生物藥物的生產技術就是微生物制藥技術。可以認為包括五個方面的內容：

第一方面菌種的獲得

根據資料直接向有科研單位、高等院校、工廠或菌種保藏部門索取或購買；從大自然中分離篩選新的微生物菌種。

分離思路新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產的要求、菌種的特性，采用各種篩選方法，快速、準確地把所需要的菌種挑選出來。實驗室或生產用菌種若不慎污染了雜菌，也必須重新進行分離純化。具體分離操作從以下幾個方面展開。

定方案：首先要查閱資料，了解所需菌種的生長培養特性。

采樣：有針對性地采集樣品。

增殖：人為地通過控制養分或培條件，使所需菌種增殖培養后，在數量上占優勢。

分離：利用分離技術得到純種。

發酵性能測定：進行生產性能測定。這些特性包括形態、培養特征、營養要求、生理生化特性、發酵周期、產品品種和產量、耐受最高溫度、生長和發酵最適溫度、最適pH值、提取工藝等。

第二方面高產菌株的選育

工業上生產用菌株都是經過選育過的。工業菌種的育種是運用遺傳學原理和技術對某個用于特定生物技術目的的菌株進行的多方位的改造。通過改造，可使現存的優良性狀強化，或去除不良性質或增加新的性狀。

工業菌種育種的方法：誘變、基因轉移、基因重組。

育種過程包括下列3個步驟：1在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入。2希望基因型的選出。3改良菌種的評價包括實驗規模和工業生產規模。

選擇育種方法時需綜合考慮的因素1待改良性狀的本質及與發酵工藝的關系例如分批或者連續發酵試驗；2對這一特定菌種的遺傳和生物化學方面認識的明了程度；3經濟費用。如果對特定菌種的基本性狀及其工藝知曉甚少，則多半采用隨機誘變、篩選及選育等技術；如果對其遺傳及生物化學方面的性狀已有較深的認識，則可選擇基因重組等手段進行定向育種。

工業菌種具體改良思路：1解除或繞過代謝途徑中的限速步驟（通過增加特定基因的拷貝數或增加相應基因的表達能力來提高限速酶的含量；在代謝途徑中引伸出新的代謝步驟，由此提供一個旁路代謝途徑。）2增加前體物的濃度。3改變代謝途徑，減少無用副產品的生成以及提高菌種對高濃度的有潛在毒性的底物、前體或產品的耐受力。4抑制或消除產品分解酶。5改進菌種外泌產品的能力。6消除代謝產品的反饋抑制。如誘導代謝產品的結構類似物抗性。

第三部分菌種保藏技術

轉接培養或斜面傳代保藏；

超低溫或在液氮中冷凍保藏；

土壤或陶瓷珠等載體干燥保藏。

第四部分發酵工藝條件的確定

微生物的營養來源

能源，自養菌：光；氫，硫胺；亞硝酸鹽，亞鐵鹽。異養菌：碳水化合物等有機物，石油天然氣和石油化工產品，如醋酸。

碳源，碳酸氣；淀粉水解糖，糖蜜、亞硫酸鹽紙漿廢液等，石油、正構石蠟，天然氣，醋酸、甲醇、乙醇等石油化工產品

氮源，豆餅或蠶蛹水解液，味精廢液，玉米漿，酒糟水等有機氮，尿素，硫酸銨，氨水，硝酸鹽等無機氮，氣態氮

無機鹽，磷酸鹽，鉀鹽，鎂鹽，鈣鹽等其他礦鹽，鐵、錳、鈷等微量元素等

特殊生長因子，硫胺素、生物素、對氨基苯甲酸、肌醇等

培養基的確定

（1）首先必須做好調查研究工作，了解菌種的來源、生活習慣、生理生化特性和一般的營養要求。工業生產主要應用細菌、放線菌、酵母菌和霉菌四大類微生物。它們對營養的要求既有共性，也有各自的特性，應根據不同類型微生物的生理特性考慮培養基的組成。

（2）其次，對生產菌種的培養條件，生物合成的代謝途徑，代謝產物的化學性質、分子結構、一般提取方法和產品質量要求等也需要有所了解，以便在選擇培養基時做到心中有數。

（3）最好先選擇一種較好的化學合成培養基做基礎，開始時先做一些搖瓶實驗;然后進一步做小型發酵罐培養，摸索菌種對各種主要碳源和氮源的利用情況和產生代謝產物的能力。注意培養過程中的pH變化，觀察適合于菌種生長繁殖和適合于代謝產物形成的兩種不同pH，不斷調整配比來適應上述各種情況。

（4）注意每次只限一個變動條件。有了初步結果以后，先確定一個培養基配比。

其次再確定各種重要的金屬和非金屬離子對發酵的影響，即對各種無機元素的營養要求，試驗其最高、最低和最適用量。在合成培養基上得出一定結果后，再做復合培養基試驗。最后試驗各種發酵條件和培養基的關系。培養基內pH可由添加碳酸鈣來調節，其他如硝酸鈉、硫酸銨也可用來調節。

（5）有些發酵產物，如抗生素等，除了配制培養基以外，還要通過中間補料法，一面對碳及氮的代謝予以適當的控制，一面間歇添加各種養料和前體類物質，引導發酵走向合成產物的途徑。

6根據經濟效益選擇培并基原料

考慮經濟節約，盡量少用或不用主糧，努力節約用糧，或以其他原料代糧。糖類是主要的碳源。碳源的代用品主要是尋找植物淀粉、纖維水解物，以廢糖蜜代替淀粉、糊精和葡萄糖，以工業葡萄糖代替食用葡萄糖；石油作為碳源的微生物發酵也可以生產以糧食為碳源的發酵產品。有機氮源的節約和代替主要為減少或代替黃豆餅粉、花生餅粉、食用蛋白胨和酵母粉等含有豐富蛋白質的原料為目標，代用的原料可以是棉籽餅粉、玉米漿、蠶蛹粉、雜魚粉、黃漿水或麩汁、飼料酵母、石油酵母、骨膠、菌體、酒糟，以及各種食品工業下腳料等。這些代用品大多蛋白質含量豐富，價格低廉，便于就地取材，方便運輸。

培養工藝的確定：

培養條件：溫度、pH值、氧、種齡、接種量、溫度

工業微生物的培養法分為靜置培養和通氣培養兩大類型。

靜置培養法即將培養基盛于發酵容器中，在接種后，不通空氣進行發酵，又稱為厭氧性發酵。通氣培養法的生產菌種以需氧菌和兼性需氧菌居多，它們生長的環境必須供給空氣，以維持一定的溶解氧水平，使菌體迅速生長和發酵，又稱為好氣性發酵。

在靜置和通氣培養兩類方法中又可分為液體培養和固體培養兩大類型，其中每一類型又有表面培養與深層培養之分。

關于液體深層培養：

用液體深層發酵罐從罐底部通氣，送入的空氣由攪拌槳葉分散成微小氣泡以促進氧的溶解。這種由罐底部通氣攪拌的培養方法，相對于由氣液界面靠自然擴散使氧溶解的表面培養法來講，稱為深層培養法。特點是容易按照生產菌種對于代謝的營養要求以及不同生理時期的通氣、攪拌、溫度、與培養基中氫離子濃度等條件，選擇最佳培養條件。

深層培養基本操作的3個控制點

①滅菌：發酵工業要求純培養，因此在發酵開始前必須對培養基進行加熱滅菌。所以發酵罐具有蒸汽夾套，以便將培養基和發酵罐進行加熱滅菌，或者將培養基由連續加熱滅菌器滅菌，并連續地輸送于發酵罐內。②溫度控制：培養基滅菌后，冷卻至培養溫度進行發酵，由于隨著微生物的增殖和發酵會發熱、攪拌產熱等，所以為維持溫度恒定，須在夾套中以冷卻水循環流過。③通氣、攪拌：空氣進入發酵罐前先經空氣過濾器除去雜菌，制成無菌空氣，而后由罐底部進人，再通過攪拌將空氣分散成微小氣泡。為了延長氣泡滯留時間，可在罐內裝擋板產生渦流。攪拌的目的除了溶解氧之外，可使培養液中微生物均勻地分散在發酵罐內，促進熱傳遞，以及為調節pH而使加入的酸和堿均勻分散等。

第五部分發酵產物的分離提取

提取方法：

過濾

離心與沉降

細胞破碎

萃取

吸附與離子交換

色譜分離

沉析（鹽析、有機溶劑沉析、等電點等）

膜分離

結晶

干燥

分離提取過程的幾個注意的問題：

水質

熱源去除（石棉板吸濾、活性碳吸附、過離子交換柱）

溶劑回收

廢物處理

生物安全性

來源：生物前沿科學

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